膜蛋白广泛分布于细胞膜系统，是信号转导、物质运输及细胞通讯的核心执行者。然而，这类蛋白通常具有高疏水性、结构复杂及丰度低等特性，导致其在常规蛋白质组学分析中检出率偏低。随着质谱技术和样本前处理策略的进步，鸟枪法（Shotgun Proteomics）在膜蛋白研究中的应用潜力日益凸显。本文聚焦于鸟枪法识别膜蛋白的技术要点与策略优化，旨在为膜蛋白组学研究提供参考。

一、鸟枪法概述：无靶向、高覆盖的蛋白组学策略

鸟枪法是一种基于“自下而上”理念的蛋白组学方法。其基本流程包括：

• 全蛋白提取
• 酶解为肽段
• 液相色谱分离
• 串联质谱分析
• 数据搜索与蛋白鉴定

该方法不依赖于预设目标蛋白，适用于复杂样本的全面蛋白表达谱解析。其高通量与高通用性的特点，使其具备探索低丰度、难提取蛋白（如膜蛋白）的潜力。

二、膜蛋白的识别难点

膜蛋白在质谱检测中面临多重挑战：

• 溶解性差：疏水结构导致常规裂解液难以提取完整蛋白；
• 酶解效率低：跨膜区缺乏胰蛋白酶识别位点，导致肽段生成不足；
• 丰度低：在总蛋白中占比小，易被高丰度可溶性蛋白掩盖；
• 肽段性质极端：部分片段电离效率差，影响质谱信号质量。

因此，针对膜蛋白特性进行流程优化，是提高鸟枪法检测效率的关键。

三、样本处理策略：提高膜蛋白提取与富集效率

1、高效裂解体系的选择

常规RIPA或PBS缓冲液难以溶解跨膜蛋白。针对性地引入以下组分，可显著提高膜蛋白溶解率：

• 去垢剂：如SDS、Triton X-100、NP-40等，有助于破坏脂双层；
• 有机溶剂：如异丙醇、甲醇等，辅助脂类溶解与蛋白释放；
• 高浓度尿素/硫脲：增强蛋白变性效果，利于后续酶解。

应注意去垢剂与质谱兼容性，必要时通过固相辅助酶解（FASP）或S-Trap系统实现脱盐与清洗。

2、富集策略提升膜蛋白比例

膜蛋白丰度低，建议采用以下方式进行富集：

• 差速离心：分离细胞膜组分；
• 碱提法：移除非膜结合蛋白，保留疏水性蛋白；
• 双相萃取：通过界面富集膜蛋白；
• 离子交换结合富集：针对带电膜蛋白特征进行选择性捕获。

这些策略可显著提升膜蛋白在总蛋白中的占比，为下游质谱分析奠定基础。

四、酶解流程优化：提升膜蛋白肽段覆盖率

1、联合酶解策略

单一胰蛋白酶常受限于膜区结构，建议使用多酶体系：

• Lys-C + Trypsin：先裂解长肽段，后补充精细切割；
• Chymotrypsin：识别芳香族氨基酸，补充疏水区域酶解；
• Asp-N、Glu-C：适用于酸性肽段的识别补全。

多酶联合不仅提升整体酶解效率，也有助于覆盖不同结构区域。

2、条件优化与助剂使用

• 适当延长酶解时间：提高蛋白质变性充分度；
• 使用变性助剂（如尿素、SDS）：增强酶对疏水肽段识别能力；
• 优化温度和pH条件：确保酶活性与蛋白溶解性的双重平衡。

结合这些措施，可显著提高膜蛋白来源肽段的数量与质谱响应。

五、LC-MS/MS策略优化：提升膜蛋白检出率

1、色谱分离优化

膜蛋白肽段往往疏水性强，保留时间长、共洗脱风险高。建议：

• 使用长梯度程序（≥120 min）：充分分离复杂肽段；
• 搭配窄孔径色谱柱：提升分辨率，减少共洗脱；
• 选择高pH反相分级：预分离肽段，降低样本复杂性。

2、高分辨质谱平台的应用

高分辨率串联质谱仪对膜蛋白肽段识别能力更强，推荐使用具备以下能力的平台：

• 高质量精度（<3 ppm）：提升鉴定可信度；
• 高速扫描速率：捕获低丰度瞬时信号；
• 动态范围广：支持从高丰度至痕量蛋白同时识别。

质谱参数的优化是膜蛋白检出率提升的重要一环。

六、数据处理与数据库搜索：增强膜蛋白识别精度

1、数据库构建建议

优先采用含膜蛋白注释的数据库子集（如UniProt中“membrane”标注条目），可显著提升匹配效率并减少假阳性。

2、软件工具选择

MaxQuant、Proteome Discoverer、MSFragger等主流蛋白组学软件均支持膜蛋白识别。建议结合以下策略：

• 允许肽段修饰搜索（如氧化、酰化）：适应膜蛋白翻译后修饰；
• 限制假发现率（FDR < 1%）：确保鉴定准确性；
• 整合谱图验证：提高低丰度膜蛋白的识别置信度。

七、应用前景：鸟枪法在膜蛋白研究中的价值

膜蛋白是当前新药开发中最具潜力的靶标类别之一，广泛分布于GPCRs、离子通道、转运体等通路。鸟枪法在以下领域具备应用优势：

• 机制研究：揭示细胞信号网络中的膜蛋白表达动态；
• 靶点筛选：支持新药靶标发现与验证；
• 肿瘤免疫研究：识别膜表抗原及其与免疫检查点的关联；
• 外泌体组学：追踪膜蛋白在胞外囊泡中的转运与功能。

膜蛋白研究因其技术壁垒一直进展缓慢。如今，鸟枪法结合先进的样本处理和质谱策略，已成为识别难检测膜蛋白的可行路径。通过系统优化提取、酶解、分离和数据分析流程，膜蛋白的质谱识别率正不断提升。百泰派克生物科技深耕蛋白组学平台建设，提供从基础科研到药物靶点研究的全流程服务，帮助客户高效识别低丰度、难检出的膜蛋白，推动研究更进一步。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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